RT-PCR是real-time PCR的话，和qPCR是一样的，都是荧光定量PCR。相比普通PCR，会加入染料，便于收集荧光信号。结果可以得出相对/绝对 浓度等多组数据，然后根据你的目的，对实际数据进行分析。还能通过ntc的ct值判断实验合不合格。
反向pcr和rtpcr一样。根据查询相关资料信息，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-timePCR一般缩写为qPCR（实时荧光定量PCR）。
前者通常要加上real time，或者写成qPCR，如果没有加的就是普通的RT-PCR了。
rtpcr时提取rna的浓度和纯度要求：浓度20ng/ul以上足够了，如果用的是组织提取，浓度一般很高，可以达到几百甚至几千。如果你用的是病毒、少量细胞，浓度低一些也没有关系。纯度需要用仪器测一下。260/280理论值应该有0以上，260/230值2以上基本合格。
在进行RT-PCR实验时，首要关注的是保护RNA的稳定性。在提取总RNA的过程中，务必谨慎操作，避免mRNA断裂，确保RNA的完整性。为了确保实验的准确性，阴性对照的设置至关重要。它能帮助排除非特异性扩增的干扰，确保实验结果的可靠性。内参的选择和使用是为了精确定量目标RNA。
最好采用巢式 PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：上游引物下游引物Ⅱ T7 启动子序列下游引物Ⅰ（2）PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板，用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR（具体操作参见PCR章节）。
⑹70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70度保存。3 RT-PCR的引物设计RT-PCR引物设计和一般PCR引物设计可以遵循同样的原则。细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。
RT 我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。
正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】反转录 实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。
RT-PCR操作步骤详解：首先，从组织或细胞中提取总RNA，确保RNA的质量和量适宜。通常，提取过程会涉及使用DEPC H2O稀释RNA样本，以及Oligo（dT）12-18作为引物。
加标准marker电泳，用照胶自动分析系统计算，可以大致定量，得其质量浓度；2，更准的是，回收PCR产物，用紫外分光光度计准确测定其质量浓度。“先算出模板链的质量然后用2的N-1次方算出扩增后DNA的数量相乘”，这是有误区的，实际的PCR反应不是理想的指数扩增过程，尤其是循环到了一定次数后。
体外转录RNA： 利用实时荧光定量PCR生成的PCR 产物可利用包含5’ T7启动子的序列和包含 3’ poly（T） 的逆转录引物重新扩增。体外转录反应生成多聚腺苷酸化正义mRNA。纯化后可将其准确定量并稀释，用于生成标准曲线。
点击start run，开始运行PCR反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异，也称之是2-DDCt。1绝对定量从标准曲线获得线性方程：Y=-432X+3638；R2=0.995，E=95%，所以可以进行数据分析。
1、rtpcr和实时荧光定量pcr区别就是过程不同，具体如下：RT-PCR一般情况下是指反转录PCR。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。
2、RT-PCR实验过程可以根据需要采取一步法或两步法。两步法的流程更为细致，首先在反转录缓冲液中进行cDNA合成，然后将反应产物的1/10分出进行PCR反应。每一步都在最适宜的条件下执行，以保证效率和准确性。
3、所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reverse transcription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也简称RT-PCR，但是这是不对的，不推荐。
4、rtpcr的基本含义是逆转录-聚合酶链反应。根据查询相关公开信息显示，RT-PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
5、所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。RTPCR一般情况下是指反转录PCRreverse，transcription，尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也realtime，fluores，cencequantitativePCR也简称RTPCR，但是这是不对的，不推荐。
这个对照是自己定义的，要在method里面说明，一般是选择阴性对照。
阴性对照用DEPC处理水代替RNA模板，其余成分相同。将上述反应成分加于0.5ml的EP管中，混匀，短时离心。将各反应管放入PCR扩增仪上，37℃ 60min，70℃变性15min，反转录产物于4℃保存备用。PCR扩增。
RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。建立反应反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。
1、mRNA一般使用RT-qPCR进行“定量”PCR。步骤前三步同于“半定量”PCR，第四步PCR的时候，用的PCR试剂，必须带有荧光素，用实时定量PCR仪检测。通过数据分析，得到mRNA的含量。
2、通过PCR可以鉴定到种 具体步骤：1将培养过的微生物（最好是青年时代的）提取基因组（这步不清楚再问我）2 通过PCR扩增，3 测定基因序列 4 和已知的基因图库上的序列比较，就可以确定是哪一个种 不过现在一般不采用基因组来比较，这样工程量太大。比较16SRNA是比较常用的方法。相对简单，准确度高。
3、它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。
